Le capitaine Malcolm Reynolds s'est porté volontaire pour les indépendantistes dans la guerre contre l'Alliance. Durant la bataille de la vallée Serenity, son côté s'est rendu. En plus de perdre la guerre, il a perdu la foi. Malcolm a donc décidé de devenir capitaine de son propre vaisseau, qu'il nomme ironiquement Serenity. Se devant de gagner son pain de toutes les manières possibles, illégales ou pas, il prend à son bord des passagers. Deux d'entre eux sont des fugitifs, recherchés par l'Alliance, qui envoie cette fois un agent, l'Opérateur.
Chronologiquement, le film reprend quelques mois après l'intrigue de la série télévisée Firefly.